In vitro...pourquoi pas!

La période d'hiver arrive... la saison des plantes est révolue pendant 3 mois...

Mais cette année je saute le pas!Ça fait quelques semaines que je lis ici et là sur cette technique.

J'ai à présent du temps pour me mettre à la culture In vitro de certaines plantes "délicates" ou reproductibles que par "clonage". Forcement les dionées, mais aussi des droseras comme Hilaris, ceux du complex petiolaris, shizandra , roridula , byblis giantea, arcurii,...enfin tout les trucs pour lesquels on s'arrache les cheveux a maintenir en vie (ou a reproduire) et pour lesquels une simple erreur est fatale!!

Le matériel arrive lundi, les solutions ne devrais pas tarder!

Si jamais quelqu'un a déjà essayé les conseils sont les bienvenus!


Pour les donnée techniques:
Je vais utilisé un bec de bunsen pour le milieu stérile, j'utiliserais une glovebox si besoin est (on verra le taux de contamination). J'établirais un protocole stricte qui évoluera en fonction des résultats. (je me base sur mon expérience avec les tube venant des USA)
Le milieux de culture va m’être fournis (je préfère ne pas jouer avec les composants pour le moment).
La désinfection se fera avec de l’hypochlorite de calcium.
Désinfection des outils a l'alcool a brûlé + bain alcool a 70 entre les mouvements.

Voilà voilà je partagerais les résultats ici !!

Bonne nouvelle et bonne chance !!
C'est vraiment super comme technique !! Si tu arrives a avoir des roridula dans un future lointain je suis prem´s !!

Lol je vais déjà tester sur dionée et droséra, car apparemment chaque espèce demande un milieu spéciale!
Une fois que je serais capable de faire mes propres milieux, ils s'agira d'en créer de nouveaux pour des espèces moins communes dans 1 ou 2ans peut être? (dans le meilleurs des cas mdr)

J'ai deja fais de l'invitro (quelques centaines de tubes) dans mon lycée c'est bien mais chiant a faire ^^

Essayez de précisez svp lol, in vitro de quoi? Tissus ou graines?Quelle plante? quel méthode de désinfection...

Chris le milieu vous l'aviez fait vous même?Donne nous toutes les infos que tu as pus retenir

Le milieu nous le faisions mais je ne souviens plus des ingrédients...
Nous avons fait presque que de la dionée ^^ pour la désinfection, une soufflerie stérile
Avec du tissu végétale

Tu pensera a moi quand tu allumera ton bec bunsen...

Crois moi c'est pas evident aux premiers abords de mettre les doigts si près d'une flamme...Mais je te souhaite de reussir et n'oublie pas : Courage, patience, et acharnement

pour manipuler correctement autour d'un bec bunsen, il faut déjà être dans une ambiance propre.
parti de là, rien de plus facile: pour éviter les contaminations il suffit de rester à proximité de la flamme et avoir des outils propres.
les outils ne doivent pas nécessairement être stériles avant emploi, seulement très bien nettoyé.
quelques secondes avant manipulation, il suffit de passer le bout de la pince à la flamme.

Et c'est normalement un "art" de steriliser les ensemenceurs etc... s'agit pas de rester bettement au dessus de la flamme ^^

Tony a tout intérêt à utiliser uniquement des pinces à pointe fine en inox, c'est facile à manier, à flamber et à nettoyer.
en restant dans le zone stérile c'est un jeu d'enfant.

Pour la désinfection du tissu, je vais le plonger jusqu’à ce que les parois soient blanche (mortes finalement), de là je couperais les parties blanches pour ensuite les mettre dans le milieu.
Pour le bec, je vais en utiliser 3 en triangle pour avoir une sorte de triangle stérile au milieu , dans lequel il est plus simple de travailler.
Pour les instruments, bain d'alcool (eau oxygénée si je vois que l'alcool est pas encore assez puissant) entre chaque mouvement, trempage dans l'alcool a brûlé et mise sur le flamme du bec avant toute utilisation.

Enfaîte j'ai fait 1er protocole setrile. De là j'ai lu des trucs sur internet. J'ai ensuite fait un 2eme protocole plus stérile encore.A chaque remarque interessante je créer un nouveau protocole.
LE but étant de commencer par le premier, a chaque contamination, d'essayer avec le suivant.

Adrien a raison c'est un jeu de patience!

Si tu as de la place, essaie de glisser une feuille de ping'...

Je viens de voir qu'un collectionneur deposait des feuilles sur un millieu de culture mais pas plus d'infos :/

Le problème étant de savoir si le milieu de culture est le même (drosera et dionée c'est différent par exemple)

Après une discussion avec erlin sur ce projet, voici les informations qu'il ma donner, je copie colle pour que vous puissiez en profiter aussi!

J'ai vu que tu voulais te lancer dans l'in vitro. J'ai déjà fait ça en cours avec un tissu de feuille de saint-paulia de 1cm². Ça fonctionne plutôt bien mais les contaminations se font très rapidement. Mais ça tu le vois aussi très rapidement au bout de 2 semaines si c'est propre c'est que tu n'as pas manipulé comme un sagouin.
Par contre j'avais travaillé sous hotte à flux laminaire et pas au bec bunsen car il faut beaucoup d'espace; Si tu travail au bec bunsen sache que tu n'as qu'une zone stérile de plus ou moins 30cm de diamètre ce qui restreint énormément ta zone de travail. Tout tes outils doivent être désinfectés et rincés entre chaque utilisation. L'alcool ne stérilise presque pas pour ne pas dire pas du tout surtout quand il s'agit de passer son scalpel ou sa pince pendant 5 secondes dans la solution. Le mieux reste quand même l'eau de javel et mieux la flamme du bec bunsen. Tes tissus doivent aussi êtres stérilisés à l'eau de javel pendant quelques minutes. Après tout dépend de la taille du fragment de son épaisseur et de sa structure. De toute façon tu le vois visuellement dès que la périphérie de ton échantillon blanchie c'est bon ton tissus est suffisamment désinfecté. C'est pour ça qu'il faut un échantillon suffisamment grand car quand tu le stérilise à l'eau de javel tu as forcément une perte de matériel. Après tu as l'histoire des ajouts d'hormones aux différents stades mais tu dois avoir ton ça dans tes protocoles.

A côté de la hotte, nettoyer le plan de travail à l'alcool et disposez:
- 2 boites de pétri contenant de l'eau additionnée de liquide vaisselle (3 gouttes)
- 2 boites de pétri contenant de la javel (3%)
Sous la hotte nettoyer le plan de travail à l'alcool et disposez :
- 8 boites de pétri contenant de l'eau distillée
- deux flacons contenant les milieux de multiplications adaptés à vos échantillons
- deux pinces stériles
Prélevez un fragment d'organe à multiplier et le nettoyer dans la boite contenant du liquide vaisselle en le frottant avec un coton tige.
En utilisant la pince stérile, transférer dans la javel et déplacer la boite de pétri sous la hotte, laisser 10 minutes. ( Pour ce passage, je me souviens qu'il faut plutôt faire au visuel. L'eau de javel va détruire les parois de ton échantillon et le vider de son matériel génétique. Tu vas observer une décoloration progressive de ton échantillon à partir de tes zones de coupe. Je te conseil de faire un test à blanc pour avoir une idée du temps avant de le faire pour de bon.)
Rincer dans de l'eau distillée, 5 minutes pour chaque bain. (Ici je ne sais plus si on avait fait autant de bain. Mais cette étape reprend le principe de la dialyse. A chaque bain tu élimineras de plus en plus les traces de ton eau de javel et des possibles éléments contaminants et indésirables).
Transférez dans un flacon en appuyant légèrement pour assurer un bon contact entre la gélose et l'organe.

J+4 à 6semaines:
En bordure des fragments végétaux vous pouvez observer une zone de multiplication cellulaire qui forme un cal. Dans des conditions stériles transférer plusieurs cale sur un milieu d'enracinement.

J+8 à 12semaines :
Le plant peut être transféré en sous sous atmosphère humide.



Voilà tout ce que je peux te dire. Pour les milieux je ne me souviens plus ce qu'ils comportaient seulement qu'il faut deux milieux distincts. Un qui contient l'hormone de multiplication cellulaire et l'autre qui contient l'hormone d'enracinement.
Je ne sais plus laquelle est laquelle mais sur internet tu devrais trouver, il s'agit de l'auxine (pour la multiplication cellulaire si je me souviens bien) et la gibbéréline (pour les racines)


PS: peut etre nous rejoindra t'il (les amateurs d'utri n'auront qu'a bien se tenir )

Dites j'ai une idée , pour ameliorer mon espace "sterile" , si je fait une rampe en "U" , une sorte de rigole dans lequel je brule de l'alcool a brulé, c'est pas mal non? et je travail au milieu + les becs de bunsen?

tu te prends pour Houdini..?

Autre question, pensez vous que l'alcool a 95% soit plus "efficace" que l'eau oxigénée?

Ecoute damien je vais tenter et je fait des photos

Gnömpom a écrit:

Autre question, pensez vous que l'alcool a 95% soit plus "efficace" que l'eau oxigénée?

pour quelle étape?
je rappelle que l'alcool ne désinfecte pas mais dégraisse.

Vernon a écrit:

Gnömpom a écrit:

Autre question, pensez vous que l'alcool a 95% soit plus "efficace" que l'eau oxigénée?

pour quelle étape?
je rappelle que l'alcool ne désinfecte pas mais dégraisse.

J'ai toujours cru que l'alcool désinfectait.. Quand j'étais môme ma mère m'a assez désinfecté à l’alcool...

Alors que doit-on utiliser comme désinfectant?

Bon ya une bonne nouvelle et une mauvaise ^^ la bonne nouvelle c'est que ça brule super bien et super longtemps sans mettre beaucoup d'alcool.
Une jolie flamme de 5 a 10cm de haut.



Mauvaise nouvelle, elle chauffe trop pour être contenue dans une tasse ^^ RIP....

Je pense donc me faire une sorte de contenant assez fin , de 2cm de haut et 20 a 30cm de large, en inox monté sur des petits pieds assez fins .

Je vais voir ça demain

L'alcool a 95 pour la désinfection du plan de travail et des outils entre les différente phase?
J'ai un bidon de 5L d'eau de javel aussi.

Quand on dit "eau sterile" ça signifie quoi? Erlin m'a parlé de 3 gouttes de liquide vaisselle ?

ta mère te désinfectait en effet, car en passant la ouate imbibée d'alcool sur tes plaies, elles dégraissait la surface de ta peau, entraînant ainsi les microbes loin de la plaie. c'est souvent mal fait car on doit nettoyer du plus prêt de la blessure vers l'extérieur. mais le système immunitaire fait souvent mieux le travail car la charge bactérienne est moindre.

Vernon a écrit:

ta mère te désinfectait en effet, car en passant la ouate imbibée d'alcool sur tes plaies, elles dégraissait la surface de ta peau, entraînant ainsi les microbes loin de la plaie. c'est souvent mal fait car on doit nettoyer du plus prêt de la blessure vers l'extérieur. mais le système immunitaire fait souvent mieux le travail car la charge bactérienne est moindre.

Merci, je mourais moins idiot.

mdrr pauvre bols !!